ADN

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12602 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Los nematodos lesionadores de raíces (NRL) del género Pratylenchus están causando daños importantes en la producción de cereales en todo el mundo. Debido al cambio climático y sin tratamientos eficientes y respetuosos con el medio ambiente, se prevé que los daños causados por los RLN aumenten. Las evaluaciones microscópicas de los NLR en el campo y en los invernaderos requieren mucho tiempo y son laboriosas. Como resultado, los productores de cereales han ignorado en gran medida esta plaga. Presentamos un método que mide el RLN en raíces de cereales infectadas utilizando un enfoque de PCR estandarizado. Se evaluaron combinaciones de cebadores de Pratylenchus negligus disponibles públicamente. Se identificó una combinación de cebadores óptima para el ensayo RT-qPCR para detectar y cuantificar P. negligus dentro de las raíces de cereales infectadas. Utilizando el ensayo de detección RT-qPCR, P. negligus pudo distinguirse claramente de otros nematodos parásitos de las plantas. Pudimos identificar ADN de P. negligus en raíces de cebada y trigo con concentraciones tan bajas como 0,863 y 0,916 ng/μl de ADN total, respectivamente. Se detectó un solo individuo de P. negligus en suspensión acuosa y dentro de raíces de cebada y trigo. El ensayo de detección RT-qPCR proporciona una alternativa sólida y precisa a la identificación y cuantificación microscópica de nematodos. Podría ser de interés para el mejoramiento de resistencia, donde se deben examinar grandes poblaciones para detectar y cuantificar P. negligus en los campos de los agricultores.

Se conocen aproximadamente 4100 especies de nematodos parásitos de plantas (PPN)1. Muchas son plagas devastadoras en la agricultura y la horticultura en todo el mundo2,3. Por ejemplo, se ha proyectado que la pérdida de rendimiento mundial causada por las PPN de los cultivos será de aproximadamente el 15 %, y en algunas regiones las pérdidas superarán el 50 %4,5,6.

Los nematodos lesionadores de raíces (NRL) del género Pratylenchus son los terceros NMP más dañinos para los cultivos en todo el mundo, después de los nematodos agalladores y quistes7,8. El daño causado por la RLN se ve afectado por varios factores, incluidas las especies de nematodos involucradas, el clima, el rango de huéspedes, la virulencia de los nematodos y los sistemas de cultivo. Los estudios han informado pérdidas de rendimiento causadas por NLR que van del 5 al 50% en varios cultivos, según el cultivo y la gravedad de la infestación2,7.

Pratylenchus negligus y P. thornei son los dos RLN más importantes en los cereales. La población de P. negligus en el suelo se correlaciona negativamente con el rendimiento del grano de trigo9. En Australia, el rendimiento del trigo puede reducirse hasta en un 30%10. P. negligus se detectó en más del 90% de los campos de trigo de tierras secas en el noroeste del Pacífico de los Estados Unidos, donde se estima que sus daños ascienden a 51 millones de dólares al año11,12,13. En Europa, los agricultores están utilizando rotaciones de cultivos estrechas y fechas de siembra tempranas, lo que causa daños cada vez mayores por RLN14,15. Un estudio sobre PPN en la agricultura orgánica en Alemania descubrió los géneros Pratylenchus y Tylenchorhynchus en más del 90% de las muestras de suelo recolectadas16. Los RLN a menudo han sido pasados por alto debido a su diversidad de especies, comportamiento migratorio, similitudes morfológicas, síntomas de daño similares por otros patógenos transmitidos por el suelo o estrés ambiental y la falta de nematólogos capacitados17. La identificación de nematodos basándose en sus rasgos morfológicos requiere mucho tiempo y una inmensa experiencia para clasificarlos. El proceso de cuantificación lleva tiempo y contar e identificar estas especies en muchas muestras es un desafío, especialmente cuando hay otros nematodos presentes. Por ejemplo, distinguir P. negligus de P. thornei y otros Pratylenchus spp. estrechamente relacionados. se basa en características morfológicas menores en el número de anillos labiales, la forma de la cola y la posición de la vulva18. Además, la identificación de especies puede complicarse por las condiciones ambientales y la variación fenotípica13,19. Debido a estos desafíos, existe la necesidad de desarrollar estrategias de diagnóstico simples y rápidas para identificar nematodos. Combinar datos morfológicos y moleculares será ideal para mejorar la resolución y confiabilidad de los estudios de diagnóstico20.

El diagnóstico de nematodos basado en ADN se ha establecido como una alternativa rápida a los análisis microscópicos. Los laboratorios comerciales ofrecen pruebas integrales basadas en ADN para cuantificar diversas enfermedades transmitidas por el suelo21,22. Sin embargo, los detalles de los protocolos utilizados se consideran propietarios y no están disponibles abiertamente. Sin embargo, se han desarrollado enfoques basados en PCR para diferenciar especies de PPN. Por ejemplo, un método que utiliza el gen de la subunidad I de la citocromo c-oxidasa (mtCOI) y las secuencias espaciadoras transcritas internas (ITS) podría identificar nematodos del quiste de la papa y rastrear su distribución en Indonesia23. Asimismo, las combinaciones de cebadores de mtCOI han distinguido cuatro especies de Aphelenchoides24. Otro estudio demostró el uso de combinaciones de cebadores específicos de mtCOI y 18S rRNA para identificar nematodos marinos y proporcionar muestras de vales. Este espécimen conservado sirve como registro verificable y permanente de nematodos25. Boroş et al. utilizaron combinaciones de cebadores que se unen a la citocromo oxidasa II (mtCO2) y a los genes de ARNr 16S para identificar cuatro especies diferentes de Meloidogyne26. La mayoría de las técnicas de diagnóstico molecular basadas en PCR identifican Pratylenchus spp. mediante la utilización de polimorfismos de ADN ribosómico (ADNr) específicos de cada especie. Pruebas de diagnóstico molecular para una amplia gama de Pratylenchus spp. se han establecido, principalmente basándose en genes de ADNr dispuestos en tándem presentes en muchas copias en el genoma27,28. De este modo, se han desarrollado enfoques de RT-qPCR para identificar P. vulnus a partir de cultivos puros y suelo29,30 y fragmentos de ADN polimórfico amplificados aleatoriamente (RAPD) para identificar P. thornei a partir de aislados de nematodos en discos de zanahoria31. Se estableció una prueba RT-qPCR basada en SYBR® Green-I para detectar y cuantificar el nematodo lesionador de raíces P. zeae, el nematodo agallador Meloidogyne javanica y el nematodo daga Xiphinema elongatum del suelo32. Además, se desarrollaron protocolos basados en RT-qPCR para detectar P. penetrans33 y P. thornei34 a partir de muestras de ADN del suelo.

Al-Banna, et al.27 informaron que diferenciaron seis Pratylenchus spp., incluidos P. negligus y P. thornei, a partir de muestras de suelo mediante PCR. Diseñaron una combinación de cebadores específicos de especie dentro del dominio de expansión D3 del ADNr 26S en un ensayo convencional basado en PCR para detectar P. negligus. Asimismo, Yan et al.28 diseñaron combinaciones de cebadores de la misma región del genoma para identificar P. negligus y P. thornei a partir de muestras de suelo, aunque con baja sensibilidad. Por lo tanto, Yan et al.35 desarrollaron una nueva combinación de cebadores para detectar y cuantificar P. negligus en el suelo dentro de las regiones ITS1 y 5.8S utilizando un método de RT-qPCR basado en SYBR® Green-I. Utilizando información de secuencia disponible públicamente, Peetz y Zasada36 diseñaron combinaciones de cebadores específicos de especies basadas en el gen de la β-1,4-endoglucanasa para diferentes especies de Pratylenchus (P. crenatus, P. negligus, P. penetrans y P. thornei) que aplicado para el monitoreo del suelo en el noroeste del Pacífico de América del Norte. Tres estudios más utilizaron una RT-qPCR basada en TaqMan con combinaciones de cebadores específicos de cada especie para detectar P. negligus. Jayatilake, et al.37 diseñaron una combinación de cebadores específicos de especie a partir de ADNr ribosómico de la subunidad grande 28S para detectar y cuantificar P. negligus dentro de raíces de trigo infectadas. Oliveira et al.38 informaron sobre un ensayo basado en RT-qPCR para detectar P. crenatus, P. penetrans y P. negligus en muestras de suelo. Calcularon el número de copias de ITS-1 por nematodo P. negligus. Finalmente, Lin et al.39 establecieron una qPCR dúplex en tiempo real con una combinación de cebadores específicos de especie dentro del dominio de expansión D2D3 del ADNr 28S para detectar y cuantificar P. negligus y P. thornei en muestras de suelo que era lo suficientemente sensible para detectar un solo nematodo entre una población de nematodos no objetivo.

Todos los métodos publicados fueron diseñados para la detección y cuantificación de P. negligus en suspensión de agua y muestras de suelo. Además, faltan protocolos de aislamiento de ADN y basados en RT-qPCR para detectar y cuantificar P. negligus en las raíces de los cereales. Por lo tanto, realizamos un estudio comparativo utilizando combinaciones de cebadores publicadas para establecer un protocolo para la detección y cuantificación rápida y rutinaria de P. negligus dentro de las raíces de cereales infectadas. Además, establecimos un protocolo para la extracción de ADN de raíces infectadas y realizamos una serie de experimentos para seleccionar la combinación de cebadores más eficaz para la detección de P. negligus. Este método de bajo costo permite un diagnóstico e identificación precisos, sensibles y eficientes de P. negligus dentro de los tejidos de las raíces de las plantas.

Buscamos en la literatura y en la base de datos Genbank combinaciones de cebadores específicos de P. negligus (Tabla complementaria 2). La secuencia que flanqueaba el cebador Neg135 era idéntica a todas las secuencias de P. negligus disponibles, incluida la entrada KY468880.1 que se había presentado como P. crenatus. La descripción morfológica de este aislado no ha sido publicada, pero su secuencia es distinta de todas las demás secuencias del Genbank de P. crenatus, pero muy similar a la de P. negligus. La secuencia que flanquea el cebador Neg236 mostró solo unos pocos aciertos BLAST de P. negligus y, por lo tanto, se excluyó de análisis adicionales. La secuencia de la expansión 28S rRNA D3 que flanquea el cebador Neg3 también se descartó porque comparte una gran similitud con secuencias de otras especies de Pratylenchus como P. minyus, P. kumamotoensis y P. vulnus. La secuencia del cebador directo Neg427 (Neg4-fw; Tabla complementaria 2) no mostró ningún resultado BLAST porque carecía de un nucleótido cebador en la posición 13. Sin embargo, la inserción de una adenina en esta posición dio como resultado una secuencia del cebador con 100% de identidad con todos los P. .descuide secuencias de la base de datos.

Todas las combinaciones de cebadores se probaron con cuatro poblaciones de diferentes especies de ADN de P. negligus por separado. Como controles se utilizó ADN total de cebada y trigo inoculados con P. negligus solo o una mezcla de las cuatro especies (Tabla complementaria 1; Tabla complementaria 3). Como resultado, la combinación de cebadores Neg1 dio el producto de PCR esperado de 234 pb (Fig. 1A), mientras que no se encontró ningún producto de amplificación con ADN de nematodo no objetivo. Mostró los resultados de PCR más confiables debido a las bandas fuertes y distintas en presencia de ADN de P. negligus (Fig. 1A). Curvas de amplificación (Fig. 1B) y un único pico de fusión a 81,5 °C (Fig. 1C) para muestras que contienen ADN puro de P. negligus, ADN de cebada y trigo inoculados con P. negligus y ADN de cebada inoculada con una mezcla de diferentes Las especies RLN demuestran el potencial de esta combinación de cebadores para amplificar el ADN de P. negligus de diferentes fuentes.

Resultados de los experimentos de PCR y RT-qPCR con ADN del RLN utilizando la combinación de cebadores Neg1. Las secuencias de cebadores, las temperaturas de hibridación y los tamaños de fragmentos esperados se proporcionan en la Tabla complementaria 2, así como el material y el método. (A) Gel de agarosa (3%, 80 V durante 60 min) con fragmentos de PCR amplificados con ADN de diferentes especies de RLN y raíces de cereales infectadas con P. negligus, (B) Curvas de amplificación RT-qPCR con ADN de Pratylenchus negligus, raíces de cereales infectados con P. negligus, otras especies de Pratylenchus y raíces no infectadas. Cada punto de datos representa la media de tres réplicas técnicas. (C) Perfiles de la curva de fusión de amplicones específicos de P. negligus. El pico está a 81,5 °C. Ninguno de los que no son P. Las curvas de amplificación de descuido tocan la línea umbral.

Se generó un producto de PCR específico de P. negligus de 293 pb con la combinación de cebadores Neg2, con dímeros de cebadores visibles en ausencia de una plantilla de ADN (Figura 1 complementaria). Además, las curvas de amplificación revelaron una sensibilidad de detección más baja, con dos o tres ciclos más antes de alcanzar el umbral (Figura complementaria 2A; Tabla complementaria 3). Los análisis de la curva de fusión mostraron un único pico a 88,5 °C (Figura complementaria 2B). La combinación de cebadores Neg3 dio un producto de PCR de 144 pb, pero los dímeros de cebadores fueron visibles en las muestras sin ADN molde (Figura 1 complementaria). Los análisis de RT-qPCR revelaron curvas de amplificación y una falta de sensibilidad en muestras de cebada y trigo inoculadas, con uno o dos ciclos más antes de alcanzar el umbral (Figura 2C complementaria; Tabla 3 complementaria) con un único pico de fusión a 90,5 °C ( Figura complementaria 2D). La PCR con la combinación de cebadores Neg4 dio como resultado dos amplicones, una banda del tamaño esperado de 290 pb y una segunda banda débil de 200 pb (Figura 1 complementaria). Además, las curvas de amplificación son aproximadamente paralelas, las curvas están cercanas entre sí (Figura complementaria 2E; Tabla complementaria 3), y el análisis de la curva de fusión reveló dos picos a 85 °C y 90,5 °C, lo que indica la amplificación de un fragmento no específico (Figura complementaria 2F).

Todos los productos de PCR fueron secuenciados por Sanger en ambas direcciones. Todas las secuencias mostraron una alta similitud con las secuencias esperadas del producto de PCR y una base de datos de referencia de secuencias conocidas (datos no mostrados).

Primero, realizamos diluciones en serie de ADN de P. negligus (a partir de ADN no diluido, 1:0 a 1:1000) para comprobar la sensibilidad de los ensayos de RT-qPCR utilizando el ADN de 2000 individuos de P. negligus utilizando la combinación de cebadores Neg1. (Tabla 1). Los resultados mostraron una correlación entre la concentración de ADN de diluciones seriadas y los valores de Cq. Los valores de Cq más bajos, 16,55 ± 0,01, y más altos, 28,87 ± 0,20, se obtuvieron con 53,4 ng de ADN/μl y 0,053 ng de ADN/μl, respectivamente (Figura complementaria 5; Tabla 1). También analizamos todas las especies de PPN con la combinación de cebadores Neg1 y detectamos eficazmente todos los aislados de P. negligus sin detectar nematodos no objetivo (Figura complementaria 3, Tabla complementaria 1).

Luego, se infectaron plantas de cebada y trigo con 1000 P. negligus. Ocho semanas después de la inoculación, se cosecharon las plantas y, como se describe en el material y el método, se utilizó un método de aislamiento de ADN modificado para aislar el ADN total de las raíces infectadas. El ADN total obtenido se diluyó a 836,4 y 916,4 ng/μl para cebada y trigo, respectivamente, para control de calidad del ADN y experimentos de PCR/RT-qPCR (Tabla 1). La PCR con la combinación de cebador Neg1 dio como resultado amplicones visibles del tamaño esperado (Figura complementaria 4). Luego, realizamos RT-qPCR con la misma combinación de cebadores y una serie de diluciones de ADN (1:0–1:1000). Los valores de Cq oscilaron entre 20,93 ± 1,14 y 29,02 ± 0,17 para la cebada y entre 20,99 ± 1,04 y 29,84 ± 0,54 para el trigo (Figura complementaria 5; Tabla 1). La eficiencia de RT-qPCR para estas diluciones en serie fue del 87% para la cebada y del 84% para el trigo. El valor de eficiencia indica cuánto puede amplificar la reacción RT-qPCR la secuencia de ácido nucleico objetivo. Las curvas de regresión lineal de diluciones en serie de ADN de P. negligus y raíces de cebada y trigo infectadas demuestran que el ADN de nematodos podría detectarse incluso dentro del ADN de raíces altamente diluido (Fig. 2). Los valores altos de R2 en todas las curvas muestran una correlación positiva entre la concentración de ADN de las diluciones en serie y los valores de Cq. Estos resultados muestran que el ensayo RT-qPCR es sensible para detectar cantidades bajas de ADN de P. negligus aislado de suspensión acuosa y raíces de cereales infectadas (Fig. 2; Tabla 1).

Valores del ciclo de cuantificación (Cq) representados frente a diluciones en serie de ADN. La RT-qPCR se realizó utilizando la combinación de cebadores Neg1. (A) Curva de regresión con diluciones en serie de ADN puro de P. negligus extraído de 2000 individuos, (B) curva de regresión con diluciones en serie de ADN total aislado de raíces de cebada infectadas, (C) curva de regresión con diluciones en serie de ADN total aislado de raíces de cebada infectadas raíces de trigo. Cada punto de datos representa la media de tres réplicas técnicas. La desviación estándar indica la variación entre tres réplicas técnicas (ver Tabla 1).

A continuación, quisimos determinar la relación entre la cantidad de nematodos y la abundancia de ADN de nematodos medida por RT-qPCR. Se recolectaron entre uno y 2000 nematodos de P. negligus bajo un microscopio estereoscópico y se aisló el ADN de cada muestra (Tabla 2). Después de RT-qPCR, los valores de Cq oscilaron entre 28,76 ± 0,08 y 16,74 ± 0,04 para un nematodo por cada 2000 nematodos, respectivamente (Tabla 2). Se obtuvieron curvas de amplificación claras y distintas para cada dilución (Fig. 3A; Fig. 6 complementaria), con una eficiencia general del 95% para RT-qPCR. La curva de regresión lineal indicó una fuerte correlación negativa entre los valores de Cq y el número de nematodos (R2 = 0,98) (Fig. 3B). Esto demuestra que la combinación del cebador Neg1 y el ensayo RT-qPCR son adecuados para cuantificar P. negligus.

Los experimentos de RT-qPCR con ADN de P. negligus aíslan PnGLS4 de un número variable de nematodos. Se utilizó la combinación de cebadores Neg1. (A) Curvas de amplificación RT-qPCR con ADN aislado de muestras con diferente número de nematodos. (B) Curva de regresión con valores del ciclo de cuantificación (Cq) obtenidos después de realizar RT-qPCR con ADN aislado de un número variable de nematodos. Cada punto de datos representa la media de los valores de Cq de tres reacciones independientes.

Realizamos dos experimentos ('A' y 'B') en el invernadero para verificar la especificidad y sensibilidad del ensayo RT-qPCR para detectar y cuantificar P. negligus dentro de las raíces infectadas. En el experimento 'A', se infectaron cebada y trigo con cuatro especies diferentes de Pratylenchus (P. negligus, P. crenatus, P. penetrans y P. thornei) por separado o como una mezcla de todas las especies. Ocho semanas después de la inoculación con 1000 nematodos, se midieron los rasgos fisiológicos (Figuras complementarias 7 y 10). Luego, las muestras de raíces se dividieron en dos grupos, uno para el recuento de nematodos y el otro para el aislamiento de ADN y RT-qPCR. El número de nematodos contados osciló entre 161 ± 72 y 1856 ± 198 para la cebada y entre 154 ± 82 y 1804 ± 135 para el trigo (Fig. 4A; Tabla 3). La mayoría de los nematodos se encontraron en tratamientos después de la infección solo con P. negligus y después de la infección con una mezcla de especies (Fig. 4A; Tabla 3), donde una combinación de cebadores específicos de P. negligus también detectó una plantilla de ADN de P. negligus (Fig. .4B; Tabla 3). Curiosamente, las tasas de infección entre cebada y trigo fueron casi similares después de la infección solo con P. negligus (cebada 1,86 ± 0,20, trigo 1,80 ± 0,14) (Tabla 3). Por el contrario, la cebada y el trigo son huéspedes pobres para P. crenatus y P. penetrans, como lo indica el bajo número final de nematodos y los valores de Pf/Pi (Fig. 4A; Tabla 3).

Experimentos de inoculación con diferentes especies de RLN. Las plantas fueron inoculadas con 1000 nematodos de diferentes especies de Pratylenchus por separado o como una mezcla de todas las especies (ver Tabla 3). Las raíces se cosecharon ocho semanas después de la inoculación y se dividieron en dos grupos. Se aisló ADN de un grupo y se contaron los nematodos del otro. La RT-qPCR se realizó utilizando la combinación de cebadores Neg1. (A) El número de nematodos después del recuento visual; (B) valores del ciclo de cuantificación (Cq). Los valores individuales y medios están marcados como puntos negros y rojos, respectivamente. Los cuartiles superior e inferior están separados por la mediana (línea horizontal). Los triángulos azules representan valores atípicos. Las barras de error representan el error estándar de la media de réplicas biológicas. Se realizó una prueba ANOVA (p < 0,05) y las diferencias significativas entre grupos se calcularon mediante una prueba de Tukey (p < 0,05). Las diferentes letras (a–d), las letras mayúsculas entre las plantas de cebada y las letras minúsculas entre las plantas de trigo encima de las barras de error representan grupos basados en la importancia (consulte la Tabla 3).

Luego, comparamos los resultados del recuento de nematodos y los datos de RT-qPCR utilizando la combinación de cebadores específicos Neg1 y P. negligus. Después de la infección con inóculo puro de P. negligus, los valores de Cq de cebada y trigo fueron 19,95 ± 1,74 y 19,42 ± 1,06, respectivamente. Fueron considerablemente más bajos después de infecciones mixtas con diferentes especies de nematodos (cebada 23,58 ± 0,92; trigo 23,90 ± 1,58). Como era de esperar, las curvas de amplificación obtenidas con ADN de raíces no infectadas con P. negligus no cruzaron la línea umbral (Tabla 3). Esto confirmó la especificidad de especie del ensayo de detección RT-qPCR (Fig. 4B; Tabla 3). También es importante señalar que P. negligus puede identificarse con precisión después de infecciones mixtas, a diferencia de la microscopía tediosa y que requiere mucho tiempo.

En el siguiente experimento ('B'), determinamos la sensibilidad del ensayo de detección basado en ADN. Razonamos que los valores del ciclo de cuantificación (Cq) están correlacionados con el número de nematodos. Se infectaron plantas de cebada y trigo con cantidades variables de P. negligus y, ocho semanas después de la inoculación, se midieron el contenido de clorofila, las raíces secas y el peso de los brotes. Como resultado, el creciente número de nematodos afectó negativamente a estos parámetros (Figuras complementarias 8 y 10). Después de la cosecha, la mitad de las muestras de raíces se utilizaron para el recuento de nematodos y la otra mitad para el aislamiento de ADN y RT-qPCR. Los nematodos dentro de las raíces se contaron bajo el microscopio. Las tasas de reproducción (Pf/Pi) disminuyeron con el aumento del número de nematodos en el inóculo (Tabla 4). Después de la inoculación con 250 nematodos, la proporción osciló entre 2,42 ± 0,52 y 2,95 ± 0,47 para el trigo y la cebada, respectivamente, mientras que después de la inoculación con 2000 nematodos, se encontró una proporción mucho menor (tanto para la cebada como para el trigo, 0,95 ± 0,05). La infección con 1000 y 2000 nematodos de P. negligus resultó en el mayor número final de nematodos. Después de la infección, el número final de nematodos con 1000 P. negligus osciló entre 1793 ± 122 y 1785 ± 139 para la cebada y el trigo, respectivamente (Fig. 5A; Tabla 4). Los valores de Cq oscilaron entre 21,20 ± 1,10 y 22,13 ± 1,70 (Fig. 5B; Tabla 4). El número de nematodos después de la inoculación con 2000 nematodos estuvo en el mismo rango (cebada 1905 ± 108, trigo 1891 ± 110) (Fig. 5A); sin embargo, los valores de Cq fueron sorprendentemente más bajos (cebada 17,82 ± 0,85, trigo 17,76 ± 1,02) (Fig. 5B; Tabla 4). Además, la correlación entre los valores de Cq y el inóculo inicial de nematodos fue negativa, con R2 oscilando entre 0,97 y 0,94 para la cebada y el trigo, respectivamente (Figura complementaria 9), lo que podría explicarse por el hecho de que el ADN de los huevos y los nematodos muertos fue amplificado. Al mismo tiempo, el método de conteo visual sólo puede evaluar el número de nematodos viables.

Los experimentos de inoculación con números variables de P. negligus aíslan PnGLS4 para determinar la correlación entre los resultados del recuento de nematodos y la RT-qPCR (consulte la Tabla 4). Las plantas fueron inoculadas con diferente número de nematodos. Ocho semanas después de la inoculación, las muestras de raíces se dividieron en dos grupos. Se aisló ADN de un grupo y se contaron los nematodos del otro. La RT-qPCR se realizó utilizando la combinación de cebadores Neg1. (A) El número de nematodos contados bajo un microscopio estereoscópico, (B) valores del ciclo de cuantificación (Cq) después de RT-qPCR. Para conocer el procedimiento experimental y las estadísticas, consulte esta figura.

Calculamos la regresión lineal entre los valores de Cq y el número de nematodos contados 8 semanas después de la inoculación, que mostró una correlación negativa r(2) = −0,93, p < 0,001 y r(2) = −0,88, p < 0,001 para la cebada. y trigo, respectivamente. Esto nos permitió calcular el número de todos los nematodos en diferentes etapas de desarrollo dentro de una raíz en función de los valores de Cq (Fig. 6).

Regresiones entre los valores del ciclo de cuantificación (Cq) y el logaritmo transferido del número final de nematodos. Las regresiones se calcularon con datos de infección del trigo y la cebada. Para la amplificación se utilizó la combinación de cebadores Neg1. Cada punto de datos es la media de quince repeticiones biológicas y tres técnicas. Las plantas fueron inoculadas con diferentes números de nematodos por planta (250, 500, 1000 y 2000) cuando tenían 10 días de edad. Ocho semanas después de la infección, se cosecharon las raíces (ver Tabla 4).

Hemos desarrollado un ensayo de detección por RT-qPCR para detectar y cuantificar P. negligus en raíces de cereales. Utilizamos información de combinaciones de cebadores disponibles públicamente y secuencias RLN de bases de datos públicas para evaluar e identificar la combinación de cebadores específicos de negligencia más eficaz hasta el estudio actual para evitar confusiones al seleccionar la combinación de cebadores específicos de cada especie. Además, presentamos un protocolo para extraer el ADN total de las raíces de cereales infectadas. Además, nos centramos en un enfoque basado en SYBR® Green porque es asequible, rápido y preciso sin reducir la sensibilidad. Es lo suficientemente sensible como para detectar el ADN genómico de un solo nematodo en una suspensión acuosa y para detectar un mínimo de ~ 250 nematodos dentro de una raíz infectada.

La muestra de ADN total representó diferentes etapas de desarrollo del nematodo, como juveniles, adultos, huevos y ADN de raíz. Sato, et al.40 demostraron que la densidad de población de P. penetrans en el suelo evaluada por RT-qPCR puede variar dependiendo de la mezcla de diferentes etapas de vida. Observaron que los valores de Cq de P. penetrans podrían variar desde la etapa adulta hasta la juvenil. Por el contrario, Yan et al.35 no informaron diferencias significativas en los valores de Cq entre una sola hembra adulta, un solo juvenil de segunda etapa y un solo huevo, lo que demuestra que las diferentes etapas de la vida de P. negligente contienen cantidades relativamente iguales de ADN. . Sus resultados también sugieren que las etapas de vida de P. negligus y las proporciones de juveniles, hembras adultas y huevos en muestras individuales no tienen ningún efecto en la detección y cuantificación de RT-qPCR y, por lo tanto, es poco probable que expliquen la discrepancia entre los niveles de nematodos medidos por RT. -qPCR y conteo binocular. Esto se debe al hecho de que, como la mayoría de los nematodos, P. negligus tiene un número fijo de células y núcleos establecidos durante el desarrollo embrionario temprano que no cambia a lo largo del ciclo de vida35.

Entre todas las combinaciones de cebadores específicos de especies analizadas aquí con el método SYBR® Green, la combinación de cebadores Neg1 proporcionó el mejor rendimiento y amplificación específica de las muestras de raíces infectadas que contienen plantillas de ADN de P. negligus en este estudio. Según investigaciones de bioinformática, laboratorio e invernadero, esta combinación de cebadores mostró especificidad, sensibilidad y falta de estructura secundaria. Esta combinación de cebadores se une dentro de las secuencias espaciadoras transcritas internas de las regiones ITS1 y 5.8S. El cebador izquierdo se une a ITS1, mientras que el cebador derecho se une a la región 5.8S. Nuestros hallazgos, junto con la información existente sobre la región del cebador Neg1 y la sensibilidad de detección de nematodos en muestras de suelo, hacen que la combinación del cebador Neg1 sea ideal para detectar e identificar P. negligus. Además, la curva de regresión lineal para diferentes números de nematodos en suspensión acuosa (1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 y 2000) demostró una fuerte correlación negativa entre los valores de Cq y el número de nematodos contados. La sensibilidad de nuestro ensayo fue comparable a la de estudios anteriores de RT-qPCR. Sin embargo, estos estudios extrajeron ADN de nematodos en suspensión acuosa o del suelo. Las poblaciones de P. thornei y P. negligus pudieron cuantificarse a partir de muestras de suelo21,34,41. En nuestro estudio, se encontró una discrepancia entre los valores de Cq y el número de nematodos contados, lo que puede explicarse por el hecho de que los huevos y los nematodos inactivos/muertos también pueden detectarse y cuantificarse directamente dentro de la raíz infectada. Por tanto, la sensibilidad del ensayo de detección RT-qPCR es mayor que la del método de recuento visual tradicional.

También observamos variaciones en el número de nematodos que se contaron bajo el microscopio. Esto puede explicarse debido a varios factores, incluida la falta de eficiencia de la cámara de nematodo, que solo puede extraer las etapas activas del nematodo, la dilución de una suspensión sincronizada de nematodos para el conteo visual, la variación en el número de nematodos en diferentes muestras biológicas debido al estilo de vida migratorio de los nematodos y al efecto de la temperatura en la reproducción de los nematodos. Todos los métodos de extracción tradicionales, como la cámara de nebulización, el embudo de Baermann y las técnicas de bandeja de dobladillo y espinillas42,43, se basan en el movimiento activo de juveniles y adultos desde el suelo humedecido o el tejido cortado hacia el agua circundante. En caso de una infección mixta, distinguir entre especies de Pratylenchus bajo el microscopio binocular es un desafío44. Además, la variación natural debida a la plasticidad fenotípica45 y la variación morfométrica entre y dentro de las especies complica aún más la identificación y cuantificación morfológica17.

RT-qPCR detecta ADN de juveniles, adultos y huevos. Además, todas las Pratylenchus spp. Las etapas de vida pueden sobrevivir dentro de la raíz y/o en condiciones áridas en una forma anhidrobiótica inactiva, deshidratada y latente31, que puede detectarse mediante RT-qPCR pero puede ser difícil de detectar mediante métodos tradicionales. Evaluar la cantidad de nematodos en el suelo es crucial para establecer umbrales económicos para iniciar contramedidas como el cultivo de variedades resistentes. El umbral de daño económico puede variar significativamente según la ubicación geográfica, el clima, la tolerancia del huésped, la virulencia de los nematodos, el valor de mercado del cultivo y el costo de las medidas de control31. Por ejemplo, Castillo y Vovlas7 informaron sobre una amplia gama de umbrales de daño de P. thornei en el trigo, que van desde 420 a 30 000 nematodos/kg de suelo en Australia, Francia y México. Dado que el ensayo de detección de RT-qPCR descrito es un método eficaz, rápido y de bajo costo para estimar el número de nematodos en función de los valores de Cq, recomendamos un nuevo método para estimar la EDT utilizando la regresión lineal generada y su fórmula basada en los valores de Cq y/o número calculado de nematodos.

El diagnóstico de plagas y patógenos basado en ADN ya se ha convertido en una rutina para los exámenes masivos de muestras de suelo en busca de la abundancia de nematodos fitoparásitos y de vida libre. En general, se acepta que los diagnósticos basados en el ADN ganarán cada vez más importancia. Según este estudio y la información disponible, recomendamos utilizar la combinación de cebadores óptima identificada y el ensayo RT-qPCR de detección basado en SYBR® Green para identificar y cuantificar P. negligus en suspensión de agua, suelo y raíz infectada. Sin embargo, proporciona una mejor comprensión al combinar métodos morfológicos y moleculares. Por lo tanto, el enfoque debe evaluarse en función del propósito del estudio, el tiempo, la fuente humana y el presupuesto estimado. El ensayo de detección presentado aquí será particularmente interesante para el fitomejoramiento, donde se deben examinar rápidamente grandes poblaciones.

Tanto el cultivar de cebada “Valentina”46,47 como el cultivar de trigo “Machete”48,49 son susceptibles a P. negligus. En el experimento 'A', se inocularon plantas de cebada y trigo con diferentes especies de Pratylenchus, utilizando 1000 nematodos por planta. En el experimento 'B', se inocularon plantas de cebada y trigo con un número creciente de un solo P. negligus. Los experimentos en invernadero se realizaron en 2021 y 2022 utilizando los protocolos descritos en Keil, et al.47.

Las semillas se germinaron en papel de filtro Whatman durante dos días en la oscuridad a 26 °C. Luego, las plántulas se trasplantaron en tubos cilíndricos de plástico con un diámetro de 4 cm y una altura de 15 cm llenos de arena esterilizada térmicamente (Probau® Quarzsand eco, tamaño de grano: 0,1–0,4 mm). Se fijaron tamices con un tamaño de malla de 20 µm de poro en el fondo de los tubos para evitar la pérdida de arena, el crecimiento de raíces y el escape de nematodos durante el experimento. Las plantas se dispusieron al azar con un espaciamiento entre tubos de 8 × 8 cm. Las plantas se cultivaron en invernadero en condiciones de día largo (16 h de luz) a 23 °C durante el día y 18 °C durante la noche con luz suplementaria (Son-T Agro 400W, Koninklijke Philips Electronics NV, Eindhoven, Países Bajos). Las plantas fueron regadas dos veces por semana desde el fondo de los tubos con una solución nutritiva, como lo describen Marshall y Ellis50. La solución nutritiva se suministró desde un tanque de 100 L y se renovó mensualmente para evitar cambios en las concentraciones de nutrientes. Todos los experimentos se realizaron en un diseño completamente al azar.

Los nematodos (Tabla complementaria 1) fueron proporcionados amablemente por el Instituto de Epidemiología y Diagnóstico de Patógenos, Instituto Julius Kühn, Braunschweig, Alemania, y los RLN se multiplicaron y mantuvieron en cultivos monoxénicos de callos de zanahoria51,52. Primero, se esterilizó la superficie de los discos de zanahoria sobre una llama y se incubaron a 23 °C durante una semana. A continuación, se esterilizaron los nematodos con sulfato de estreptomicina (10%) y en cada disco se colocaron 200 nematodos en diferentes etapas de desarrollo. Luego, cada placa de Petri que contenía un disco de zanahoria se selló con parafilm y se almacenó en la oscuridad a 25 °C. Cada dos semanas se comprobó que los cultivos de discos de zanahoria no estuvieran contaminados. Noventa días después de la inoculación, los nematodos se extrajeron de los callos de zanahoria para realizar pruebas de infección en invernadero. Para preparar el inóculo inicial, se contaron los nematodos en tres muestras de 500 µl de suspensión de nematodos. El inóculo total se ajustó con agua estéril hasta una concentración final de 500 nematodos por ml. Luego se utilizaron 2 ml de suspensión de nematodos para inocular las plantas. Finalmente, se contaron visualmente y se mezclaron un número igual de cuatro especies de Pratylenchus para preparar el inóculo de especies mixtas de nematodos.

Las plántulas se cultivaron durante diez días en el invernadero antes de la inoculación de nematodos. Después de la inoculación, la arena se cubrió con perlas de plástico negro para evitar el crecimiento de algas. Ocho semanas después de la inoculación, se cosecharon las plantas. Se midieron los pesos secos de brotes y raíces y se determinó el contenido de clorofila mediante un instrumento Dualex (Force A, París, Francia), según Casa, et al.53. Después de eso, se cortaron los brotes, la mitad de las muestras de raíces se colocaron en un liofilizador para aislamiento de ADN y RT-qPCR, y la otra mitad en una cámara de nebulización para extraer los nematodos para el recuento visual. El número de nematodos por planta se contó tres veces en un ml de suspensión utilizando un estereomicroscopio (aumento de 32 veces). El número total de nematodos se calculó para toda la suspensión de nematodos de cada planta. Los valores de Pf/Pi se calcularon como la relación entre el número final de nematodos al final de la prueba (Pf) dividido por el número inicial de nematodos utilizados para inocular las plantas (Pi).

Se modificó aún más un protocolo para aislar el ADN total de raíces de cereales infectadas, incluido el ADN de nematodos y plantas27. Después de cosechar las plantas ocho semanas después de la inoculación, se liofilizó toda la raíz de cada planta y se homogeneizó con un Geno/Grinder 2010 (SPEX@SamplePrep LLC, EE. UU.) durante tres minutos a 1000 golpes por minuto. Luego se agregaron cinco ml de tampón de extracción por gramo de raíz seca. La mezcla se incubó durante la noche a 56 °C en un baño de agua. Se combinó un ml de la mezcla homogeneizada con un ml de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) y fenol (1:1) en un tubo nuevo, se agitó vigorosamente durante 10 minutos y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. (RT). Luego, se transfirieron 700 µl del sobrenadante a un tubo nuevo y se combinaron con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se agitaron durante 10 minutos y se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 rpm a temperatura ambiente. Este paso se repitió dos veces y, finalmente, el ADN se precipitó añadiendo 400 µl de isopropanol helado a -20 °C durante la noche. Los tubos se centrifugaron a 4 °C durante 15 min a 10.000 rpm y posteriormente los sedimentos de ADN total se lavaron con etanol al 70 % y al 95 % durante cinco minutos. Después de secar a temperatura ambiente, el ADN total se resolvió en 200 µl de TE bajo. La calidad del ADN total se comprobó mediante electroforesis en gel y se cuantificó con un fluorómetro Qubit™ 4 (Invitrogen de ThermoFisher Scientific, Singapur). Antes de la RT-qPCR, el ADN total se diluyó hasta una concentración final de 10 ng/μl.

El ADN del nematodo se extrajo con ligeras modificaciones utilizando el protocolo de Al-Banna et al. (2004). Primero, se recogió un número distinto de nematodos obtenidos después del recuento en 100 µl de agua destilada y se congelaron y descongelaron tres veces durante 30 minutos a -80 °C. Luego, se agregaron 0,2 ml de tampón de extracción con 2 µl de Proteinasa K (Biotechrabbit™) y los nematodos lisados se mantuvieron durante la noche a 56 °C en un baño de agua. Al día siguiente, se añadió cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) después de agitar, se separaron las fases y se precipitó el ADN con un volumen de isopropanol frío a -20 °C. Finalmente, los sedimentos de ADN se lavaron dos veces con etanol al 70% y se resolvieron en TE bajo.

Se realizaron búsquedas en la literatura y en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) para encontrar combinaciones de cebadores específicos de P. negligus. Encontramos cuatro combinaciones de cebadores que se habían utilizado para estudios de PCR y RT-qPCR (Tabla complementaria 2). Dado que este estudio tenía como objetivo desarrollar un ensayo de detección rápido, asequible y preciso, la atención se centró en el uso del método SYBR® Green. La PCR se llevó a cabo con un ciclador térmico Life Touch (TC-96, Hangzhou Bioer Technology Co., LTD. China) en un volumen de 20 µl que contenía la plantilla de ADN (2 µl), 0,1 µl de Taq-polimerasa (Biozym Scientific GmbH) , 0,4 µl de dNTP 10 mM, 0,3 µl de 10 pM de cada cebador y 2 µl de tampón de PCR 10 × (Biozym Scientific GmbH). Se analizaron cinco µl de los productos de la PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 3%. La amplificación se produjo en un termociclador utilizando el siguiente programa: 5 min a 94 °C como desnaturalización inicial; seguido de 35 ciclos de 30 s a 94 °C para desnaturalización; 30 s a una temperatura de recocido específica de cada combinación de cebador (Tabla complementaria 2), 30 s a 72 °C para la extensión y extensión final a 72 °C durante 5 min. Además, se utilizó el sistema de detección de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX ConnectTMOptics Module para RT-qPCR (Bio-Rad Laboratories, Inc., Singapur). Por lo tanto, se mezclaron 10 µl de Platinum® SYBR® Green (qPCR SuperMix-UDG con ROX) (Invitrogen) con cinco µl de solución de ADN normalizada de diez ng/µl, un µl de solución de cebador (10 pM) y 3 µl de agua destilada. El ciclo térmico se programó durante 3 min a 95 °C como desnaturalización inicial, seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 °C para desnaturalización, 30 s a una temperatura de recocido específica de cada combinación de cebadores (Tabla complementaria 2), 30 s a 72 °C para extensión y extensión final a 95 °C durante 10 s. Para confirmar la secuencia flanqueada con cada combinación de cebadores, se secuenciaron productos de PCR de combinaciones de cebadores específicos para P. negligus utilizando la secuenciación Sanger y CLC Main Workbench versión 23.0.3 (CLC bio, Aarhus, Dinamarca).

El programa Primer3 (versión 4.1.0) se utilizó para la longitud de validación, la temperatura de fusión, el contenido de GC y otras características de amplificación por PCR, como la optimización del diseño del cebador en función de condiciones específicas de la PCR, como la temperatura de hibridación, la concentración de MgCl2 y la concentración de ADN molde54. 55. Se utilizaron Beacon Designer™ Free Edition y el software mFold para predecir estructuras secundarias, sus temperaturas de fusión, la estabilidad de los dúplex de ADN y el potencial de interacciones de unión al ADN55. Las secuencias del cebador se sometieron a BLAST contra la base de datos de nucleótidos del NCBI y el genoma de referencia de la cebada (//www.ncbi.nlm.nih.gov/) para identificar supuestos sitios de unión no específicos55.

Los datos de RT-qPCR se analizaron con la versión 3.1 del software Bio-Rad CFX Manager™. La eficiencia de amplificación (E) se calculó a partir de la pendiente de una gráfica del ciclo de cuantificación (Cq) (eje y) y log picogramos (log pg) de ADN (eje x) usando la ecuación E = (10(1/ –m) – 1) × 100, donde m es la pendiente56. El ANOVA se realizó con el paquete de programas “Agricolae” en el software R Studio, versión 4.1.0. y las diferencias significativas entre grupos se calcularon mediante una prueba de Tukey (p <0,05).

Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en este manuscrito y sus archivos de información complementaria. Los datos, la información y los materiales adicionales utilizados en este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices pertinentes. Los datos de secuencia obtenidos en este estudio están disponibles de forma abierta en GenBank del NCBI en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ con los números de acceso OR050567, KM593901, OR052247 y OR052248.

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Descargar referencias

Agradecemos el apoyo técnico de Bettina Rohardt, Verena Kowalewski y Monika Bruisch. Además, agradecemos al profesor Johannes Hallmann (Instituto Julius Kühn, Instituto de Epidemiología y Diagnóstico de Patógenos, Braunschweig, Alemania) por proporcionar las poblaciones de nematodos. Este estudio fue financiado parcialmente por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF) (Subvención No. 031B0186A).

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Fitomejoramiento, Universidad Christian-Albrechts de Kiel, Olshausenstr. 40, 24098, Kiel, Alemania

Ehsan Fatemi, Siegbert Melzer y Christian Jung

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EF diseñó y realizó los experimentos, seguido de analizar los datos. SM y CJ dirigieron el diseño del estudio y supervisaron el análisis de datos. El manuscrito fue redactado por EFEF, SM y CJ lo revisaron. Todos los autores leyeron y aprobaron el artículo final. La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a CJ.

Correspondencia a Christian Jung.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Fatemi, E., Melzer, S. y Jung, C. Evaluación basada en ADN de infecciones por nematodos lesionadores de raíces en raíces de cereales. Representante científico 13, 12602 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39559-8

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Recibido: 12 de mayo de 2023

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39559-8

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